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为生物实验做出大贡献的小动物(三)———萤火虫
奥盛 发布时间:2022-04-26 奥盛 来源: 奥盛 浏览量:354

01.为什么萤火虫会发光

萤火虫经过长期的进化,演化出位于腹部腹面的特殊发光器官,幼虫的发光具有警戒、恫吓天敌的作用,而成虫则可以利用闪光进行种的辨认、求偶及诱捕。萤火虫的发光细胞内存在着大量的萤火虫荧光素酶,荧光素酶在腹部气管末端细胞摄入的氧气以及细胞内荧光素颗粒的参与下进行发光。通过神经控制气管的收缩来调节氧气的进出,从而造就了萤火虫在夜间一闪一闪的发光。

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02.萤火虫荧光素酶的起源

自二十世纪五十年代起,科学家陆续得到了萤火虫荧光素酶与荧光素的结晶,并通过测定荧光素的结构成功化学合成了荧光素。随后,生物学家们一直致力于研究荧光素酶的催化反应机制。直到1985年,De Wet等首次从北美萤火虫发光器官中获取总mRNA,反转录获得荧光素酶的cDNA全序列并且克隆到大肠杆菌体内,最后成功表达出有活性的荧光素酶。之后,De Wet等又陆续在哺乳动物细胞、植物细胞内进行表达,均取得突破。继而掀起了其他各种属荧光素酶的克隆研究和采用基因工程菌表达荧光素酶的序幕。


03.萤火虫荧光素酶的反应过程

荧光素酶是生物体催化自身发光的一种蛋白质。在反应过程中,它以荧光素、ATP和氧为底物,镁离子为激活剂,可高效率地将化学能转变为光能。

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04.Allsheng® ATP生物发光检测试剂盒

三磷酸腺苷(ATP)是生物能量的主要来源,普遍存在于所有活的生物体中。萤火虫荧光素酶可高效利用ATP催化底物荧光素的转化发射出光子。根据在一定浓度范围内,发光信号与存在的ATP量呈正比的原理,进行ATP的生物发光检测。

材料

•Allsheng® ATP生物发光检测试剂盒

•Feyond-A300多功能酶标仪

•96孔白色不透明板(赛默飞:236105)

标品配置

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操作过程

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仪器参数设置

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图1. 标品布局及参数界面

结果

Allsheng® ATP生物发光检测试剂盒在10-11-10-16mol的分析范围内具有优异的线性拟合度。Feyond-A300内置的数据处理软件可直接将ATP标准品浓度与光强度进行标准曲线拟合,给出曲线方程与R2,提供的标准曲线可直接对样品进行高精度测定,无需电脑操作,报告包含标准曲线与样品浓度等信息。


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图2. ATP标准曲线(Std1-Std6)

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图3. ATP标准曲线(Std3-Std6)

报告基因的应用

萤火虫荧光素酶作为一种报告基因,可用于鉴定融合表达的目的蛋白表达情况、启动子的转录活性、信号通路上下游靶基因的表达调节情况及研究特定环境下细胞代谢通路的改变等。奥盛Feyond-A300多功能酶标仪可实现对多种荧光素酶的高通量检测。


参考文献:

[1]罗展浩. 北美萤火虫荧光素酶在毕赤酵母中的表达、纯化及其特性研究[D].华南理工大学,2018.

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